Фагоцитарную функцию клеток периферической крови принято оценивать по проценту фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарному числу (среднее число микроорганизмов, захваченных одним гранулоцитом) и абсолютному фагоцитарному показателю, который является отвлеченной величиной, полученной в результате умножения фагоцитарного числа на количество нейтрофилов, фагоцитирующих в 1 мм 3 крови.

Иными словами, абсолютный фагоцитарный показатель - это число микробов, которые способны поглотить нейтрофилы, содержащиеся в 1 мм 3 крови. При постановке реакций фагоцитоза используют взвесь убитых микроорганизмов и кровь больного. После инкубации крови и бактерий в термостате готовят мазки, окрашивают их и оценивают поглотительную способность гранулоцитов.

Для постановки реакции фагоцитоза используют также взвесь живых микроорганизмов. В этих случаях фагоцитарная активность гранулоцитов будет в 2 - 2;5 раза ниже, чем в реакциях с убитыми бактериями.

Розеткообразующие свойства нейтрофилов . В последние годы выяснено, что нейтрофилы человека имеют на поверхности своей мембраны рецепторы к ряду компонентов комплемента и Fc-фрагментам иммуноглобулинов. Установлено также наличие на мембране нейтрофилов рецепторов к эритроцитам барана.

Как и лимфоциты, нейтрофилы могут быть разделены на популяции по их способности к спонтанному розеткообразованию с эритроцитами барана и к комплементарному розеткообразованию с аллогенными эритроцитами в присутствии комплемента и иммуноглобулинов.

Постановка реакций спонтанного и комплементарного розеткообразования нейтрофилов аналогична постановке реакций спонтанного и комплементарного розеткообразования лимфоцитов.

Комплементарная активность сыворотки крови. Компоненты комплемента биологически инертны, но при активации комплексом антиген - антитело приобретают свойства энзимов и играют выраженную (защитную или деструктивную) роль в иммунном цитолизе. Помимо цитолиза, комплемент непосредственно участвует в различных проявлениях неспецифической защиты организма и главным образом в различных фазах воспалительной реакции, как клеточной, так и гуморальной.

Среди этих проявлений наиболее изучена активность комплемента, приводящая к высвобождению гистамина и повышению проницаемости капилляров, управляющая хемотаксисом и повышающая фагоцитирующую способность нейтрофильных гранулоцитов, способствующая иммунному прилипанию и опсонизации фагоцитирующих частиц, нарушению клеточной стенки и т. д.

Повышая проницаемость мелких кровеносных сосудов, комплемент, по-видимому, участвует в управлении миграцией гранулоцитов.

Система комплемента представлена белковыми молекулами, которые локализуются в альфа- и бета-глобулиновых фракциях и состоит из 11 белков сыворотки крови, составляющих 9 компонентов.

Для активации системы комплемента необходимы специальные субстанции, в результате воздействия которых компоненты комплемента активируют один другого в строгой последовательности (каскадное или секвенциальное включение) двумя путями - классическим и альтернативным (или пропердиновым).

Активация по классическому пути вызывается комплексом антиген - антитело, агрегированным иммуноглобулинами классов G и М, или комплексами полианион - поликатион, таким, например, как гепарин-протаминовый комплекс. При этом первый компонент комплемента (С1) образует С1-эстеразу, которая расщепляет четвертый (С4) и второй (С2) компоненты комплемента, способствуя образованию СЗ-конвертазы классического пути.

Альтернативный путь активации комплемента является эволюционно более древним. Он наиболее важен в антибактериальном защитном механизме до того, как начнут вырабатываться специфические антитела. Активация по альтернативному пути вызывается агрегированными иммуноглобулинами классов А и Е, растворимыми и нерастворимыми полисахаридами оболочек бактерий и не требует наличия С1-, С4- и С2-компонентов комплемента.

В первой стадии на поверхности активатора образуется энзим как результат взаимодействия факторов компонента СЗ. Энзим очень лабилен, но способен расщеплять СЗ и таким образом способствовать образованию более эффективной СЗ-конвертазы. Образование СЗ-конвертазы и расщепление под ее влиянием третьего компонента комплемента являются узловыми моментами обоих путей активации.

На этой стадии происходят комплементзависимые клеточные взаимодействия. Так называемые комплементарные мосты принимают участие в индукции иммунных ответов, элиминации иммунных комплексов и контроле бактериальных инфекций. Образование таких мостов длительное время было известно как иммунное прилипание.

Этот феномен используется в тесте комплементарного розеткообразования. Оба пути активации комплемента ведут к генерации биологически активных фрагментов компонентов комплемента. Так, система комплемента активируется агентами, постоянно присутствующими в нормально функционирующем организме.

В процессе эволюции развились и механизмы контроля ее активации. Существуют два основных механизма регуляции активации комплемента. Первый присущ самой системе и заключается в лабильности СЗ-конвертазы обоих путей, что лимитирует активацию последующих компонентов комплемента, участвующих в каскадном включении активации (С5 - С9).

Второй осуществляется специальными природными белками-ингибиторами. Из них наиболее важны С1-ингибитор, который образует комплекс с фрагментом С2, не давая ему дальше расщеплять С4 и С2, и таким образом контролирует сборку СЗ-конвертазы классического пути, и СЗ-инактиватор, который служит основным контрольным белком системы комплемента, расщепляя СЗ в жидкой фазе на два гемолитически неактивных белка.

Имеются данные об изменениях в системе комплемента при различных патологических состояниях. Так, Kassel (1977) у более чем 5000 больных раком различной локализации установил дефицит комплемента и его компонентов.

Отдельные компоненты сывороточного комплемента обычно определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием моноспецифических антисывороток к тому или иному компоненту. Активность комплемента оценивают также по его способности лизировать эритроциты в присутствии антител против них.

За единицу гемолитической активности комплемента принимают активность, необходимую для лизиса 50% эритроцитов в присутствии антител. Используя метод кинетического титрования, реакцию можно записать во времени. Эта реакция качественная и не дает представления о концентрациях комплемента и его компонентов.

«Коррекция иммунитета у больных раком
предстательной железы», В.А.Савинов

Фагоцитоз -- процесс, при котором специально предназначенные для этого клетки крови и тканей организма (фагоциты) захватывают и переваривают твердые частицы. Открытие фагоцитоза принадлежит И. И. Мечникову. Он осуществляется двумя разновидностями клеток: циркулирующими в крови зернистыми лейкоцитами (гранулоцитами) и тканевыми макрофагами. У животных фагоцитировать могут также ооциты, плацентные клетки, клетки, выстилающие полость тела, пигментный эпителий сетчатки глаза.

Механизм фагоцитоза однотипен и включает 8 последовательных фаз: 1) хемотаксис (направленное движение фагоцита к объекту);

2) адгезия (прикрепление к объекту);

3) активация мембраны (актин-миозиновой системы фагоцита);

4) начало собственно фагоцитоза, связанное с образованием вокруг поглощаемой частицы псевдоподий;

5) образование фагосомы (поглощаемая частица оказывается заключенной в вакуоль благодаря надвиганию на нее плазматической мембраны фагоцита подобно застежке-молнии;

6) слияние фагосомы с лизосомами;

7) уничтожение и переваривание;

8) выброс продуктов деградации из клетки.

Фагоцитозу часто предшествует процесс опсонизации (от греч. opsoniazo -- снабжать пищей, питать) объекта. Объектом является клетка, которая несет чужеродную информацию. Инициатором этого процесса является образование на поверхности клетки комплекса антиген-антитело. Антитела, локализуясь на поверхности чужеродной клетки, стимулируют активацию и присоединение к ним белков системы комплемента. Образующийся комплекс действует как активатор остальных стадий фагоцитоза.

Более детально этапы фагоцитоза выглядят следующим образом:

1. Хемотаксис. Чужеродные клетки (опсонизированные или неопсонизированные) посылают в окружающую среду хемотаксические сигналы, в направлении которых начинает двигаться фагоцит. Ранее других клеток в очаг воспаления мигрируют нейтрофилы, позже - макрофаги.

2. Адгезия фагоцитов к объекту. Обусловлена наличием на поверхности фагоцитов рецепторов для молекул, представленных на поверхности объекта (собственных или связавшихся с ним). Акт адгезии включает две фазы: распознавание чужеродного (специфический процесс) и прикрепление, или собственно адгезию (неспецифический процесс). В случае если отсутствует предварительное специфическое распознавание чужеродных клеток, адгезия фагоцитирующей клетки к объекту фагоцитоза происходит крайне медленно.

3. Активация мембраны. На этой стадии осуществляется подготовка объекта к погружению. Происходит активация протеинкиназы С, выход ионов кальция из внутриклеточных депо. Большое значение играют переходы золь-гель в системе клеточных коллоидов и актино-миозиновые перестройки.

4. Погружение. Происходит обволакивание объекта. В процессе фагоцитоза плазматическая мембрана макрофага при помощи образованных ею выступающих складок захватывает объект фагоцитоза и обволакивает его.

5. Образование фагосомы. Происходит замыкание мембраны, погружение объекта с частью мембраны фагоцита внутрь клетки. Образующаяся при этом небольшая вакуоль называется фагосомой.

6. Образование фаголизосомы. Слияние фагосомы с лизосомами, в результате чего образуются оптимальные условия для бактериолиза и расщепления убитой клетки.

7. Киллинг и расщепление. В фагосоме захваченная чужеродная клетка гибнет. Для осуществления киллинга макрофаг продуцирует и секретирует в фагосому реакционноспособные производные кислорода. Основные вещества, участвующие в бактериолизе: пероксид водорода, продукты азотного метаболизма, лизоцим и др. Процесс разрушения бактериальных клеток завершается благодаря активности протеаз, нуклеаз, липаз и других ферментов.

Переваривание захваченного и убитого материала - завершающий этап фагоцитоза. Для этого с фагосомой, содержащей объект фагоцитоза, объединяются лизосомы, которые содержат более 25 различных ферментов, в число которых входит большое количество гидролитических энзимов. В фагосоме происходит активация всех этих ферментов, так называемый метаболический взрыв, в результате которого фагоцитированный объект переваривается.

8. Выброс продуктов деградации.

Фагоцитоз может быть:

ѕ завершенным (киллинг и переваривание прошло успешно);

ѕ незавершенным (для ряда патогенов фагоцитоз является необходимой ступенью их жизненного цикла, например, у микобактерий и гонококков).

Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессах, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям.

Для исследования фагоцитарной функции используют:

ѕ подсчет абсолютного числа фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов);

ѕ оценку интенсивности поглощения микробов фагоцитами;

ѕ определение способности фагоцитирующих клеток переваривать захваченные микробы.

Наиболее информативным для оценки активности фагоцитоза считают фагоцитарное число, количество активных фагоцитов и индекс завершенности фагоцитоза.

Наиболее распространенным методом количественного определения и характеристики морфологических дефектов нейтрофилов является лейкограмма и цитологические исследования с использованием световой и электронной микроскопии.

Для определения хемотаксической активности нейтрофилов применяют метод исследования миграции лейкоцитов с использованием камеры Бойдена. Метод основан на разделении микропористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: нейтрофилов и хемотаксических агентов (например, C5a), которые помещаются в нижнюю камеру и создают концентрационный градиент. Помещенные в верхнюю камеру нейтрофилы мигрируют вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра. После стандартной инкубации фильтры извлекают, окрашивают и подсчитывают количество клеток. Метод довольно прост и отличается весьма высокой воспроизводимостью. Этот же принцип лежит в основе метода клеточной миграции под агарозным гелем, который используется для определения хемотаксического индекса.

Для фагоцитарного числа норма -- 5-10 микробных частиц. Это среднее количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов. Определяется путем подсчета количества поглощенных бактерий одной клеткой после инкубации клеток пациента со стандартными препаратами St.aureus или E.coli и окраски полученных мазков. Модификацией этого теста является метод определения бактерицидной активности, при котором отмытая суспензия клеток инкубируется с бактериальной суспензией, затем смесь наносится на поверхность кровяного агара и через определенное время подсчитывается количество выросших бактериальных колоний. Оба метода требуют стандартизации для использования в каждой конкретной лаборатории и сведений об антибиотикотерапии, которая может быть причиной недостоверных результатов или ошибок в их интерпретации.

Фагоцитарная емкость крови в норме -- 12,5-25х10 9 на 1 л крови. Это количество микробов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови.

Фагоцитарный показатель в норме 65-95%. Это относительное количество нейтрофилов (выраженное в процентах), участвующих в фагоцитозе.

Количество активных фагоцитов в норме -- 1,6-5,0х10 9 в 1 л крови. Это абсолютное количество фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови.

Индекс завершенности фагоцитоза в норме -- более 1. Он отражает переваривающую способность фагоцитов.

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так как при этом нарушается функция разрушения и выведения иммунных комплексов из организма.

Спонтанный тест с НСТ(нитросиний тетразолий) - в норме у взрослых количество НСТ-положительных нейтрофилов составляет до 10%. Этот тест позволяет оценить состояние кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов (гранулоцитов) крови in vitro. Он характеризует состояние и степень активации внутриклеточной НАДФ-Н-оксидазной антибактериальной системы. Феномен респираторного (или метаболического) взрыва связан со значительным увеличением кислорода, поглощаемого лейкоцитами при фагоцитозе, в результате чего происходит образование супероксидного радикала (О 3-) и перекиси водорода. Все эти соединения обладают микробоцидными свойствами, и их идентификация представляет собой важный этап в оценке функциональной активности фагоцитарных клеток.

Показатели НСТ-теста повышаются в начальный период острых бактериальных инфекций, тогда как при подостром и хроническом течении инфекционного процесса они снижаются.

Снижение спонтанного теста с НСТ характерно для хронизации воспалительного процесса, врожденных дефектов фагоцитарной системы, иммунодефицитов, злокачественных новообразований, тяжелых ожогов, травм, недостаточности питания, лечения некоторыми лекарственными препаратами, воздействия ионизирующего излучения.

Повышение спонтанного теста с НСТ отмечают при антигенном раздражении вследствие острого бактериального воспаления, лейкоцитозе, усилении антителозависимой цитотоксичности фагоцитов, аутоаллергических заболеваниях, аллергии.

Активированный тест с НСТ используется для определения фагоцитарной метаболической (кислородо-зависимой) активности нейтрофилов. Тест включает в себя инкубацию нейтрофилов с НСТ in vitro, и по формированию нерастворимых окрашенных зерен формазана можно судить о восстановлении НСТ супероксидным радикалом, образующимся при активации фагоцитов. Отсутствие осадка свидетельствует о неспособности клеточной популяции фагоцитов к метаболизму.

В норме у взрослого человека количество НСТ-положительных нейтрофилов составляет 40-80%. Снижение показателей активированного НСТ-теста нейтрофилов ниже 40% и моноцитов ниже 87% свидетельствует о недостаточности фагоцитоза.

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация результатов

Описание

Метод определения Оценка фагоцитоза бактерий с флюоресцентной меткой.

Исследуемый материал Цельная кровь (гепарин)

Доступен выезд на дом

Фагоциты являются одним из главных компонентов врождённого иммунитета. Они обеспечивают первую линию в защите организма от инфекции. В основе защитной функции лейкоцитов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать чужеродные клетки. Как высокочувствительный индикатор нормы и патологии, характеристики фагоцитов служат полезным инструментом не только иммунологической, но и общеклинической диагностики. Данные по фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов (содержание клеток, фагоцитировавших при инкубации бактерии с флюоресцентной меткой) позволяют оценить резервные возможности этих клеток по поглощению и перевариванию чужеродных агентов.

Литература

1. Dufour D. Clinical use of laboratory data: a practical guide. - Williams & Wilkins. - 1998
2. Tietz Clinical guide to laboratory tests. 4-th ed. Ed. Wu A.N.B.- USA,W.B Sounders Company, 2006
3. Иммунологические методы./Под ред. Г. Фримеля – М., Мир - 1979.
4. Клиническая иммунология и аллергология/ Под ред. Г. Лора-младшего, Т. Фишера, Д. Адельмана. Пер. с англ. – М. Практика. 2000.
5. Лимфоциты. Методы./Под ред. Дж. Клауса.- М., Мир -1990.
6. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. Казань:Магариф. – 1993.
7. Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология – М., Мир. – 2000.
8. Симонова А.В. Фенотип лимфоцитов при воспалительных заболеваниях. – М., ИНТО. 2001. – 250 с.
9. Ярилин А. А. Основы иммунологии – М., Медицина. - 1999.

Подготовка

Строго натощак (в период с 7.00 до 11.00) после ночного периода голодания от 8 до 14 часов.

Накануне исследования необходимо исключить повышенные психоэмоциональные и физические нагрузки (спортивные тренировки), приём алкоголя, за час до исследования - курение.

Показания к назначению

• Рецидивирующие инфекции, инфекционные заболевания с хроническим и затяжным течением.
• Подозрение на генетически обусловленный или приобретённый иммунодефицит.
• Аутоиммунные заболевания.
• Онкологические заболевания.
• Обследование реципиентов до и после трансплантации органов.
• Обследование пациентов перед серьёзными оперативными вмешательствами. Осложнённое течение послеоперационного периода.
• Контроль терапии цитостатиками, иммунодепрессантами и иммуномодуляторами

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в Независимой лаборатории ИНВИТРО:

• % фагоцитирующих гранулоцитов от общего количества гранулоцитов;
• % фагоцитирующих моноцитов от общего количества моноцитов.

Референсные значения:

• % фагоцитирующих гранулоцитов: 82 - 90%;
• % фагоцитирующих моноцитов: 75 – 85%.

Лабораторная оценка нарушений врожденного иммунитета

Функциональная оценка В-лимфоцитов

Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях является одним из наиболее важных интегральных показателей функциональной полноценности В-лимфоцитов и всей системы регуляции гуморального адаптивного иммунитета.

Традиционно концентрацию сывороточных иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини . В настоящее время этот метод все еще находит свое применение, предпочтение отдается моноклональным антителам против отдельных антигенных детерминант (эпитопов), характерных для отдельных классов иммуноглобулинов.

Принцип метода Манчини заключается в том, что образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агара, в которых содержатся антитела против IgM, IgG, IgA в стандартной концентрации. Иммуноглобулины, содержащиеся в исследуемой сыворотке, диффундируют в агар и при взаимодействии с соответствующими антителами образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации. Окончательный размер кольца преципитации зависит от концентрации соответствующих иммуноглобулинов. Метод Манчини позволяет определить концентрацию иммуноглобулинов, равную 10 мкг/мл. Ошибка метода составляет 10%.

Для диагностики нарушений врожденного иммунитета обычно определяют фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и оценивают состояние системы комплемента.

Наиболее информативными для оценки фагоцитарной системы следует считать фагоцитарный индекс, фагоцитарное число (отражает поглотительную способность нейтрофилов) и индекс бактерицидности (отражает переваривающую способность нейтрофила).

Фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа.

Фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий или частиц латекса, поглощенных в расчете на один нейтрофил.

Также проводятсятесты спонтанного и стимулированного фагоцитоза с использованием частиц латекса. Фагоцитоз с латексом основан на поглощении частиц латекса нейтрофилами (адгезия, захват и полное поглощение).

При проведении спонтанного теста лейкоциты, выделенные из периферической крови, смешивают с суспензией частиц латекса; при проведении теста индуцированного фагоцитоза к полученной смеси добавляют раствор пирогенала. После инкубирования при 37 0 С в течение 30 минут готовят мазки, а затем в фиксированных и окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках подсчитывают процент нейтрофилов, поглотивших латекс.

Тест восстановления нитросинего тетразолия –НСТ-тест позволяет оценить метаболическую активность гранулоцитов крови, выявляет резервные возможности внутриклеточных систем фагоцитов. НСТ-тест основан на восстановлении поглощенного лейкоцитами крови растворимого красителя – нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан черного цвета (внутриядерные включения – глыбки диформазана) под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцитоза.

Постановка реакции . На обезжиренное предметное стекло наносят 0,02 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ (нитросинего тетразолия).

В качестве нагрузки используют коммерческий липополисахарид грамотрицательных бактерий E. coli или раствор пирогенала (липополисахарид S. typhi) в разведении 1:10. На другое обезжиренное стекло наносят 0,02 мл ЛПС, 0,02 мл нейтрофильной взвеси и 0,02 мл 0,75% раствора НСТ. Помещают во влажную камеру на 30 минут. Готовят мазки, высушивают, фиксируют. Окрашивают 0,1% раствором нейтрального красного. Учитывают нейтрофилы, высчитывая процент лейкоцитов с гранулами восстановленного НСТ (диформазан черного цвета).